Il chiostro grande, il primo dopo l'ingresso, è a pianta rettangolare e venne realizzato tra il 1426 e il 1443. Presenta, al centro, una statua marmorea di San Benedetto e, in un angolo, una vera di pozzo, anch'essa in marmo, costruita nel 1439. Il lato più antico presenta un particolare doppio loggiato in corrispondenza del primo e del secondo piano, con archi a tutto sesto poggianti su colonne in mattoni con capitelli in pietra.

Le pareti delle quattro gallerie al pian terreno sono interamente dipinte con gli affreschi delle Storie di San Benedetto, realizzati da Luca Signorelli e Antonio Bazzi detto Il Sodoma. Si tratta di una delle più importanti testimonianze della pittura italiana dell'epoca rinascimentale.

Gli affreschi del Signorelli sono otto e vennero realizzati nel 1497-98. I restanti sono del Sodoma e vennero realizzati dal 1505 in poi.